Zwei Jahre sind inzwischen vergangen, als Peter Parker (Tobey Maguire) von einer genmutierten Spinne gebissen wurde und sein Leben sich radikal verändert hat. Bei der Verbrechensbekämpferei lässt er sein College-Studium schleifen und verspätet sich permanent bei seinen beiden Jobs. Zu allem Überfluss muss Peter mit ansehen, wie Mary Jane (Kirsten Dunst) im Gegensatz zu ihm ihr Leben meistert. Nun allerdings streckt ein neuer Bösewicht namens Dr. Octavius (Alfred Molina) seine metallischen Tentakel nach der Zivilisation aus. Mit ihm ist nicht zu spaßen...